【检测】GB 4789.3-2016 大肠菌群测定及GB 4789.4-2016 沙门氏菌检验 标准解读 (标准补充)!

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楼主 2018-06-21 22:46:19
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GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数


第一法 大肠菌群MPN法


1、当限量值单位为MPN/g或MPN/mL时采用本标准的检验方法(注意与2003版区分)。


2、取样原则:本标准中对应的检样量分别为0.1g(mL)、0.01g(mL)、0.001g(mL),根据样品限量值,查阅附录部分MPN表:

(1)无论固体或液体,当限量值为“<3.0”或其它任意能在标准“表1”中查到的数值,则分别取1mL 1:10的样品匀液接种到3管单料LST肉汤管、分别取1mL 1:100的样品匀液接种到3管单料LST肉汤管、分别取1mL 1:1000的样品匀液接种到3管单料LST肉汤管;


(2)无论固体或液体样品的限量值为“<0.3”或其它任意为MPN表中查到的数值缩小10倍的数值,则分别取10mL样品1:10稀释液接种到3管双料LST肉汤管、分别取1mL 1:10的样品匀液接种到3管单料LST肉汤管、分别取1mL 1:100的样品匀液接种到3管单料LST肉汤管(如蜂蜜的限量值为0.3MPN/g,即采取此做法)。


3、凡产酸或产气的LST管,都取1环接种GBLB肉汤管,凡BGLG产气者记为阳性。


第二法 大肠菌群平板计数法

(常见问题汇总)


1、VRBA培养相关问题
(1)所用器皿是否需要灭菌?
答:不需要。配制培养基所用到的锥形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要灭菌,但要求一定要清洗干净,表面无污渍、无残留。煮沸完成后,取下锥形瓶,用一般常用的卫生纸(软纸)覆盖瓶口,用橡皮筋缠绕,待冷却至适宜温度即可倾注培养基。在倾注培养基时,须点燃酒精灯,稍微灼烧锥形瓶口。


(2)如何保持“煮沸2min”?
答:可以用电磁炉或电热板进行加热煮沸,在该培养基即将煮沸时调低温度。实际操作时,不需要严格按照此要求进行,加热煮沸数秒即可。原因:本培养基很难保持煮沸2min,一旦煮沸,则培养基很快上涌、翻腾,若不调低温度或立刻采取其他措施,则培养基可在数秒内喷涌出来,严重者可喷涌2米以上、电磁炉周围1—2米范围内都是培养基飞溅的范围(实验室危险因子之一)。


(3)若培养基未用完,是否可以冷藏起来下次用?
答:不可以。4789.28中已规定,固体培养基最多允许熔融1次(指的是经过高压灭菌冷却后的培养基还可以熔融一次后使用)。且VRBA培养基冷却后,再次熔融时非常容易喷涌,若温度控制不当,底部培养基熔融后很快就会发生喷涌(即培养基未完全熔融就会发生喷涌现象)。


(4)倾注完成后是否需要“覆盖一层”?如何覆盖?
答:一般情况下不需要覆盖。在实际操作过程中,若检验员初次接触该食品(或食品品类),则有必要在倾注培养基后再覆盖一层(原因是不清楚该样品是否会发生蔓延)。而如此往复测试几次后,若该样品或食品品类均不存在蔓延现象,则以后的实验中都不需要进行覆盖。若重复多次测试后都有蔓延现象,则以后的检验中最好都进行覆盖,最好是在原培养基已凝固或半凝固(不会发生晃动)时再倾注一层培养基(“一层”是指缓慢倾注培养基至培养基刚好能够覆盖整个平皿)。

2、如何确定培养基上长的是不是大肠菌群?
答:建议新手们认真按照标准进行证实试验,此证实试验简单易操作,每一次VRBA上有菌落生长都进行证实试验,如此往复3-4次,对于哪种形态才是大肠菌群已经能够了然于心。


3、两个梯度都长了菌,如何选取?
答:选取15-150CFU之间的平板(指的是VRBA平板上所有菌落数在此范围),挑取可疑菌落进行证实试验。详细举例说明:若有两个连续梯度的4个平板上菌落数均在15-150之间,则4个平板上的菌落都要挑取进行证实试验,实际操作时,可灵活操作,如:1:10的两个平板上的菌落数分别为120、123,1:100的两个平板的菌落数分别为16、18,严格来讲必须至少在每个平板上分别挑取5个可疑菌落、5个典型菌落进行证实试验,如此需要40根GBLB肉汤管。建议使用镍合金接种环(即传统的接种环,而不是一次性塑料接种环),因为VRBA上生长的菌落(无论典型或可疑)大部分长在底层、且菌落一般较大,被培养基覆盖,传统的接种环较细,用以刮去上层培养基较方便,挑取菌落也较方便。

4、如何进行证实试验?菌落选取数量?
答:同上所述,建议新手们VRBA上的所有不同形态的菌落都进行证实试验。每种不同形态都挑取5-10个进行证实试验(若BGLB管足够,建议多挑取几个进行试验)。
注意:A.每种可疑菌落挑取5个,每个菌落放入1管GBLB管中;B.“产气者,记为大肠菌群阳性管”,就要求在实验前须认真筛选BGLB管,凡产气的GBLB管应弃去不用。

5、结果如何计算?
答:首先,在VRBA培养24h后进行计数,分别计数可疑大肠菌群和典型大肠菌群(何为可疑、何为典型?同“2”,检验员多进行几次实验后自然很清楚典型的大肠菌群是何种形态)的数量。假如在1:10的平板上可疑大肠菌群有10个,典型大肠菌群有6个;其次,进行证实试验,挑取上述可疑和典型大肠菌群各5个(或者全部挑取),假如10个可疑大肠菌群中有3个证实为阳性,6个典型大肠菌群中有5个证实为阳性,则计算方法如下:最终大肠菌群数=经证实的大肠菌群数=可疑大肠菌群经证实的数量+典型大肠菌群经证实的数量=10×(6/10)×10+6×(5/6)×10=110。

6、若平板上很多菌落,最终证实全部为阴性,结果如何计算?
答:根据第3条,选取适宜菌落数的平板挑取菌落进行证实试验,若证实全部为阴性,则需要再挑取更低稀释度的平板上的菌落(建议可疑和典型菌落分别挑取10个)进行证实试验,若第二次证实试验均呈阴性,以<1乘以最低稀释度进行计算,如:1:10的平板菌落数分别为120、123,1:100的平板上菌落数分别为16、18,首先挑取1:100的两个平板上的菌落进行证实试验,若全部为阴性,再挑取1:10的两个平板上的菌落进行证实试验,若1:10的平板上的菌落数证实为阴性,则最终计算过程为<1x10,最终结果为<10;若1:10的的平板上的菌落有阳性管,则按照第5条进行计算。

 

第三部分、GB/T 4789.3-2003 《大肠菌群测定》——标准解读

(标准补充)


1、凡限量值单位为MPN/100mL或MPN/100g的都采用本标准:



2、由于MPN表中给出的检样量为1mL(g)、0.1mL(g)0.01mL(g)三个稀释度,所以:

(1)无论固体或液体,当限量值为“<30”或其它任意能在标准“表1”中查到的数值,则分别取10mL 1:10的样品匀液接种到3管双料乳糖胆盐发酵管、分别取1mL 1:10的样品匀液接种到3管单料乳糖胆盐发酵管、分别取1mL 1:100的样品匀液接种到3管单料乳糖胆盐发酵管(有时限量值≤300,也建议同样操作);


(2)若液体样品的限量值为“<3”,则分别取10mL样品原液接种到3管双料乳糖胆盐发酵管、分别取1mL样品原液接种到3管单料乳糖胆盐发酵管、分别取1mL 1:10的样品匀液接种到3管单料乳糖胆盐发酵管,9管皆为阴性则符合该限量值。


3、大肠菌群在EMB培养基上的典型形态特征,参考GB 5750-2006中总大肠菌群发酵法相关章节。但仍然建议:一旦有菌落数生长,无论是否为典型形态,都应挑取进行革兰氏染色及证实试验。


4、最后一次证实试验,凡乳糖发酵管产气(无论气泡大小)且革兰氏染色镜检为阴性则判定为大肠菌群阳性。



GB 4789.4-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验

(标准补充)


1、称取25g样品于可封口的均质袋中,再倒入BPW至250g,尽量排去均质袋中的空气后再封口、均质后直接置于36±1℃培养箱中培养过夜(标准要求为8~18h,一般培养过夜后第二天早晨继续下一步试验)


2、TTB、SC应酌情配制,现配现用,不宜久置。若BPW放入培养箱的当日时间允许,则可将TTB、SC灭菌、配制、分装后冷藏以备第二天实验;若当日时间不允许,则次日早晨灭菌、分装,下午即可转接培养。


3、TTB:灭菌条件为121℃、20min,与一般试验耗材、孟加拉红培养基的灭菌条件一致,故在灭菌时可考虑同时灭为一锅。且须同时灭一些带塞(可带塑料盖子)的小试管、10mL移液枪枪头、1mL移液枪枪头,在灭菌完成后温度降至不烫手时,轻轻晃动三角烧瓶使底部白色沉淀物浮起而充分混匀,每100mLTTB中加入1支碘液(陆桥,P-72)、1支0.1%煌绿(陆桥,P-73),充分摇匀至整瓶TTB呈现绿色,此时用移液枪准确吸取10mLTTB至已灭菌的小试管中,盖上盖子。取1mLBPW增菌液至1管TTB中,于42℃培养18~24h(若时间允许、或18h后观察试管仍无浑浊,则培养至24h,否则培养至18h即可)。


4、SC:仅需加热煮沸灭菌(因SC易溶于水,煮沸即可,无需过度加热),冷却至不烫手时用移液枪吸取10mL分装至已灭菌的小试管中,盖上盖子。取1mLBPW增菌液至1管SC中,于36±1℃培养18~24h(若时间允许、或18h后观察试管仍无浑浊,则培养至24h,否则培养至18h即可)。


5、BS、XLD应酌情配制,在用前一天配制后备用(两者仅需加热灭菌、不添加任何添加剂,无需过度加热)。BS在不烫手时即可倒成平板,否则容易沉淀或凝固,且在倒平板前应充分摇匀以防止有效成分沉淀于底部(棕色或棕黄色颗粒物)。XLD过度加热会造成琼脂不易凝固、划线时容易划破,甚至不凝结成块、无法倒置。


6、XLD培养条件:36±1℃培养18~24h。18h后观察,若TTB、SC增菌液都有菌落生长,则可挑取任意生长良好的菌落进行生化鉴定试验;若只有其中一种增菌液有菌落生长、或两者都无菌落生长,则继续培养至24h再观察,此时无论菌落生长与否都不再继续培养,只要其中任一增菌液有典型或可疑沙门氏菌生长则挑取进行生化试验。


7、生化鉴定:

(1)一般情况下,XLD上的任一增菌液长菌,则BS上对应增菌液也会长菌,此时若已挑取XLD上的菌落进行生化试验,则无需挑取BS上的菌落;或XLD上的两种增菌液长了形态特征完全相同的菌落,则挑取任一典型菌落进行生化鉴定即可,且无论BS上菌落生长如何,都不再挑取BS上的菌落进行生化试验。


(2)若出现XLD未长菌的增菌液在BS上长菌,则还需挑取BS上的该菌落进行生化试验。


(3)用生化鉴定试剂盒进行生化鉴定,依据产品说明书判断阴性或阳性,再根据标准中表2~表5的内容逐步进行判定(即生化鉴定试剂盒是将标准中的所有鉴定步骤同时完成,但判定时依然要按照标准逐步判定,只要其中任一阶段可判定为非沙门氏菌属,则不再往下判定,鉴定试验即终止)


(4)若判定为沙门氏菌属,则可选择进行或不进行血清凝集试验。首先应确定该菌落无自凝性,否则无法进行血清学试验。


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